Общие вопросы по выращиванию культуры на агаре.

[Hamsabala]

Я думаю, многим будет интересно понаблюдать, а потом самим заняться таким увлекательным процессом как посев спор и перенос мицелия на питательные среды в чашках Петри.

Моя цель - после мультиспоровой инокуляции методом переноса мицелия выделить равномерно и быстро растущий мицелий.

Рабочий материал:

Psilocybe Cubensis "Burma"

Psilocybe Cubensis Colombian Rust Spore

 

 

 

Начало.

День 1.

После последних приключений, описанных в Части 1. У меня оставалось несколько чашек Петри с мицелием Psilocybe Cubensis "Burma". Этот мицелий не подходил для иколуляции зерна, и я решил продолжить его пересадку на агаре. Я взял Т4 мицелий и сделал пятый перенос. Получил 13 чашек Петри.
В этот же день я инокулировал спорами еще 6 чашек: 3*Burma + 3*CRS

 

День 2. 

Burma активизоровалась и в споровых, и в мицелиевых чашках. CRS тоже активизировался, но через 12 часов.

 

День 3. 

Во всех чашках со спорами появились признаки бактерий. В половине Т5 чашек тоже. Это случилось из-за одного моего нововведения в процесс работы, которое я, по понятным причинам, больше использовать не буду. Решено было споры перенести в новые чашки, а за Т5 чашками еще последить. 
Итого, я располагаю следующими материалами:
Т5 мицелий - 13 чашек
Споры Burma - 6 чашек
Споры CRS - 6 чашек

 

День 4.

Мицелий, споры, бактерии... все живет.

 

День 5.

Споры почти во всех чашках оживились. CRS отстает от Burma, активизируется позднее, развивается намного медленнее, споры на в одной чашке даже не активизировались. На снимках ниже явно видна разница в скорости развития.

Два лучших экземпляра Burma:

Лучший экземпляр CRS:

 

День 6.

Вот несколько фото неудачных переносов, за которыми теперь интересно наблюдать:

 

День 7-9.

Вот так выглядят чашки со спорами:

Споры Burma растут быстрее, но более хаотично.

 

Вот так выглядят почти все не зараженные контаминантами чашки с Т5 мицелием

Мицелий растет равномерно, это уже хороший результат изолирования культуры. Нет ризоморфных образований. На их отсутствие может влиять слишком питательный агар. В нем достаточно питательных веществ, и мицелию не надо быстро расти в поисках пищи.

 

Бактериальные противостояния продолжаются.

На последнем фото и не бактерии вовсе. Оказался незаметный кусок мицелия, который тоже вырос, слился со старшим братом и двинулся вместе с ним.

 

Завтра или послезавтра будет работа по переносу на новый агар.

 

И напоследок пару гифок

 

День 10.

Сегодня была операция по спасению от бактериального заражения Т5 мицелия. Шестой перенос этой культуры, полученной из спор 40 дней назад.

Из 8 зараженных чашек, я вырезал и пересадил 13 кусочков. Я выбирал  области мицелия, которые максимально удалены от участков с бактериями и удалены от края чашки. Это минимизирует возможность переноса бактерий.
Также я сделал трансфер мицелия из чашек со спорами. Я взял одну чашку Burma и одну чашку Rusty Spore, и вырезал из них по 3 кусочка.
Для этих переносов я сделал слабо питательный агар, чтобы посмотреть, покажет ли Т6 мицелий ризоморфный рост и как себя поведет на бедной среде сопровый мицелий после первой пересадки.

 

День 11.

Сегодня оставшиеся Т5 чашки и чашки с мицелием после споровой инокуляции отправлены в холодильник. В холодильнике я имею чашки с 3-м, 4-м и теперь 5-м переносом. Изменения в равномерности и скорости роста мицелия после каждого переноса очень заметны. Фото:

 

Наблюдения и работа теперь будут вестись с Т6 мицелием и ТС1 (первый перенос после инокуляции спорами) мицелием. Через 24 часа после переноса Т6 и ТС1 мицелий показывают активность. На всех перенесенных кусочках агара виден рост мицелия, он уже перебирается на новый агар.

 

День 12.
Все растет. Вот два фаворита 2-го дня роста:

Т6 мицелий уже формирует ризоморфы.

 

День 13.

Все растут. Фаворит сегодняшнего дня.

 

День 14-17

Сегодня я убрал все, кроме одной, чашки в холодильник.

По порядку.

Т6 мицелий Burma. Это 6-й пренос мицелия, и за все время я так и не добился 100% ризоморфоного мицелия ни в одной чашке. Вот 4 чашки Т6 мицелия. 

Работа с этим мицелием не останавливается. В будущем я планирую:

- инокулировать им зерно

- пересадить на более питательный агар, когда получу солодовый экстракт.

 

Про первый перенос Burma после споровой инокуляции тоже говорить нечего. мицелий прозрачный, пушистый, 

 

Первый перенос Colombian Rust Spore радует. Несмотря на то чно это далеко не изолированная культура, растет он равномерно. 

 

Одну из этих чашек я оставил, что бы мицелий продолжал расти. Все остальное, теперь в холодильнике ждет свего часа.

 

Изменено 20 июня 2020 пользователем Hamsabala

[Hatarakimas]

Желаю  успеха в твоих изысканиях и получении опыта . Почти одновременно с тобой стартанули с похожими целями)) 

[Hamsabala]

@Hatarakimas благодарю

[shturman]

Привет!

Интересно читать, и фотки хорошие!

Не мог бы ты рассказать чуть больше о материалах и технике работы?

Похоже ты используешь чашки из какого-то пластика. Они одноразовые, или их можно стерилизовать в скороварке?

Чем ты их заклеиваешь? Специальной пленкой, типа Parafilm, что используют заокеанские гроверы, или чем-то еще?

Может подскажешь где купить чашки и ленту?

Как ты переносишь агар между чашками и банками? Гловбокс? Ламинар? Можешь показать конструкцию?

 

Спасибо, и удачи в опытах!

[Hamsabala]

@shturman , благодарю.

 

6 часов назад, shturman сказал:

Похоже ты используешь чашки из какого-то пластика

Это пластиковые, стерильные одноразовые чашки Петри. Мне больше понравилось работать с ними, чем со стеклянными.

 

6 часов назад, shturman сказал:

Чем ты их заклеиваешь?

Заклеиваю Parafilm-ом. Сейчас нет возможности за ним съездить, так что в дело идет обычный скотч, который, к слову, очень неприятно пахнет при нагреве в парнике.

 

6 часов назад, shturman сказал:

Может подскажешь где купить чашки и ленту?

Чашки - пробахилы.рф

Parafilm -  в поисковике напиши "parafilm купить (свой или ближайший город)"

 

6 часов назад, shturman сказал:

Как ты переносишь агар между чашками и банками? Гловбокс? Ламинар? Можешь показать конструкцию? 

Процессы эти описаны до мелочей уже много раз. Возможно и я, когда возникнет необходимость, сделаю подобное.

Я использую SAB - still air box. Позднее напишу подробнее.

Изменено 19 апреля 2020 пользователем Hamsabala

[Hamsabala]

UPD

Добавлен День 6. С бактериальными видами.

[POPSA]

8 минут назад, Hamsabala сказал:

UPD

Добавлен День 6. С бактериальными видами.

  Супер) И да, каждый сам определяет свой путь)

[shturman]

@Hamsabala , спасибо за ответ!

Скажи пожалуйста, ты эти чашки используешь повторно, или выкидываешь?

И насчет Parafilm, на али есть дорогой брэндовый парафильм, а есть какой-то дешевый "садовый".

Садовым дешевым на фотографиях приматывают какие-то ветки фруктовых деревьев, прививают что-ли.

Каким ты пользуешься?

Еще интересен рецепт агара, ( тот что используешь ты ) 

 

И не совсем понятно что делают в финале с супер классным результатом на агаре. 

(Когда ты решаешь вырастить с него урожай, и тебе нужно много обросшего зерна)

Кусочек/кусочки помещают в банку, потом G2G трансфер? (кажется не удобным)

Делают жидкую культуру?

 

6 часов назад, Hamsabala сказал:

Процессы эти описаны до мелочей уже много раз.

Извини что отвлекаю!

Да, есть куча хороших видео где все показано (грибы начали мне их демонстрировать на youtube задолго до того,

как я решился, точнее понял что все более чем реально осуществить ) 

По этому сильно разжевывать не нужно.

Мне итересен именно твой опыт реализации на практике, в наших условиях.

Имею ввиду доступность товаров и адаптацию к нашим реалиям.

В общем, если будет настроение, напиши. 

 

Спасибо! 

[Hamsabala]

5 часов назад, shturman сказал:

Скажи пожалуйста, ты эти чашки используешь повторно, или выкидываешь?

Выкидываю

 

5 часов назад, shturman сказал:

И насчет Parafilm, на али есть дорогой брэндовый парафильм, а есть какой-то дешевый "садовый".

Я пользуюсь Parafilm. Тот садовый тоже испольуют с чашками Петри. Его я заказал себе для пробы.

 

5 часов назад, shturman сказал:

И не совсем понятно что делают в финале с супер классным результатом на агаре. 

В финале берется чашка Перти с мицелием для пересадки. Мицелий можно  разрезать на кусочки 1*1см, можно крупнее. Чем больше будет кусочков в банке, тем быстрее заростет зерно. Обычно  мицелием из одной чашки я инокулюрую до 4-х литровых банок. Просто переношу агар в подготовленную банку с зерном. Делаю так, чтобы в одной банке было не меньше 4-х кусочков агара с мицелием. После того, как переносы сделаны, очень активно перетряхиваю банки.

 

5 часов назад, shturman сказал:

Еще интересен рецепт агара, ( тот что используешь ты ) 

Сейчас я  использую 2 рецепта агара.

 

С кукурузной мукой

1 литр воды

20 грамм агара

10 грамм кукурузной муки

5 грамм фруктозы

 

С ржаным солодом

1 литр воды

20 грамм агара

20 грамм ржаного солода

Это рабочий рецепт, основа. Иногда я что-то в него добавляю, ищу оптимальный для себя рецепт.

 

После 2-3-х переносов я меняю агар, чтобы культура не "расслаблялась".

Когда я делаю перенос в чашки, которые уйдут на хранение в холодильник, я использую менее питательный агар с кукурузной мукой.

Когда я делаю перенос в чашки, которые пойдут на инокуляцию банок с зеном, я использую рецепт с ржаным солодом. Так как я использую только рожь (иногда смесь ржи и пшеницы), то тем самым я сокращаю период задержки после инокуляции, который наблюдается, когда мицелий сталкивается с новой средой/компонентами.

[shturman]

Благодарю за подробный ответ!  

[Hamsabala]

В 19.04.2020 в 20:35, Hamsabala сказал:

Я использую SAB - still air box. Позднее напишу подробнее.

SAB - still air box - бокс с неподвижным воздухом.

Это может быть любой прозрачный контейнер подходящего размера. В нем надо сделать отверстия для рук. Внутри SAB-а происходит минимум движений и следовательно минимум движения воздуха, а это минимизирует вероятность заражения контаминантами. Его можно использовать с крышкой, а можно ставить на влажное полотенце, натертое антибактериальным мылом. Но SAB не отменяет подготовительную работу по очистке пространства и себя перед работой. Но со временем, становится понятно, что на очистку помещения можно тратить меньше внимания.

Как видно на фото, у меня старый, местами заклееный контейнер размером 40*30*25см, 30 литров. Это, наверное, минимально допустимый размер\объем. В нем достаточно места для работы с 5-10 чашками Петри или 4-мя литровыми банками. Но вот для работы  с 6-ю банками или с двумя десятками чашек лучше иметь контейнер бОльшего объема.

[shturman]

@Hamsabala , спасибо что делишься, Бро!

Ты не стал пристегивать перчатки к боксу? Считаешь это лишнее?

Пользуешься спиртовкой для стерилизации скальпеля? Зажигаешь ее внутри ящика, или снаружи?

Прикидывал как делать отверстия для рук в своем ящике, и решил что наверно буду делать одно на узкой стороне, 

а второе на широкой, и подальше от первого. Кажется так будет удобнее. 

Хотя наверно это зависит еще и от того, где стоит ящик, и удобно ли будет работать/стоять с угла.

 

Про садовый парафильм - подумал что он наверное нестерильный в отличие от брендового.

 

Как думаешь, если в твоем базовом рецепте агара заменить всю воду и солод на литр отвара овса (подходящей для жидкой культуры концентрации),

получится годный агар для натаскивания мицелия на овес?

[Hamsabala]

3 часа назад, shturman сказал:

Ты не стал пристегивать перчатки к боксу?

Я пробовал, вся прелесть неподвижного воздуха пропадает, рукава толкают туда-сюда воздух. С рукавами требуется герметичность.

 

3 часа назад, shturman сказал:

Зажигаешь ее внутри ящика, или снаружи? 

Снаружи и подальше от отверстий. В SAB-е может накопиться много паров спирта.

 

3 часа назад, shturman сказал:

Про садовый парафильм - подумал что он наверное нестерильный в отличие от брендового. 

Parafilm не стерильный.

 

3 часа назад, shturman сказал:

Как думаешь, если в твоем базовом рецепте агара заменить всю воду и солод на литр отвара овса

Будет годный, с картофелем так делают, но добавляют ещё декстрозу/фруктозу 10гр на литр.

[Hamsabala]

UPD
Добавлен День 7-9. Фотоотчет.

[Hamsabala]

UPD

Добавлен День 10. Спасение от бактерий.

[Hamsabala]

UPD

Добавлен День 11. Фотоотчет

[Hamsabala]

UPD

Добавлен день 12 и 13.

 

Сегодня я наконец раздобыл газовую горелку. Пришел конец спиртовкам, свечкам и зажигалкам. Скальпель накаливается за пару секунд!

И всего за 2000р, а не за 5-6 т.р., что просят за такую в Европе и США

Войдите или зарегистрируйтесь для просмотра содержимого. Купить семена конопли.

[Hamsabala]

UPD

Добавлен день 14-17. Заморозка

[Hamsabala]

Вчера сделал второй перенос Colombian Rust Spore
Рецепт агара пока не менял.

[UltraFreak]

В 06.05.2020 в 07:05, Hamsabala сказал:

Вчера сделал второй перенос Colombian Rust Spore
Рецепт агара пока не менял.

Хороший опыт, помню начал с петри возиться - а они расплавились, дешёвый платик оказался! Закуплю на этот раз стеклянные, многоразовые и начну на агаре чудить, интересно было бы увидеть селекцию стрейна "RustyWhyte" - по идее там изначально с принта генетика мощнее!

[Hamsabala]

6 часов назад, UltraFreak сказал:

по идее там изначально с принта генетика мощнее!

Почему у тебя сложилось такое мнение?

[UltraFreak]

17 минут назад, Hamsabala сказал:

Почему у тебя сложилось такое мнение?

Сэр WarFlop меня просветил! Этот стрейн вывел Канадский шрумер PastyWhyte, там изначально шёл отбор всех лучших качеств от скрещиваемых стрейнов, далее его изолировали, т.е. принты с очень хорошего изолята на порядок лучше принтов с мультиспоры, на шрумери.орг можешь глянуть его заметки! От того и РастиВайт так понравился Crazy_Monaco, в его репорте вырос лес грибов, да и в других волны обильные, сам его с мультиспоры растил - грибки как на подбор, что редко со взвеси бывает...

[Hamsabala]

Спустя неделю второй перенос со спор Colombian Rust Spore выглядит вот так.

 

Три последних дня не следил за ними, и сегодня обнаружил интересное явление - мицелий разделяется по краю, будто кто-то вырезает от него кусочки.

Изменено 11 мая 2020 пользователем Hamsabala

[Hamsabala]

Вот самый яркий пример этого феномена

[Hamsabala]

 

Самая вероятная версия - клетки мицелия умирают из-за заражения пенициллином. Я достал из холодильника материнскую чашку, на мицелии кажется есть сине-зеленая плесень. Чашку перенес в тепло, понаблюдаю...