Агар

[WarFlop]

Афтор репорта - c10h12n2o 
Афтор перевода - WarFlop
Адаптировал текст как мог, кое где не смог ;) результаты перевода могут не совпадать с оригиналом, но смысловая нагрузка таже.

 

 

 

 ВСТУПЛЕНИЕ:

 

 

 

Агар широко распространен в профессиональной микологии (или в любой другой форме микробиологии). В ранние времена, когда люди просто использовали разные тэки, профессионалы уже десятилетиями использовали агар. По этой причине многие люди были запуганы агаром и его выдающимися способностями на острие микологии, считая, что это инструмент, предназначенный для людей с надлежащими лабораториями и степенями, выходящими далеко за рамки среднего увлечения. Это было очень ошибочно, потому что на самом деле сделать агар не сложнее, чем делать желе, и есть много методов агара, которые принесут пользу даже самым новым новичкам. Агар удалит все ваши догадки и фактически гарантирует успех. По этой причине в наши дни мы советуем людям начинать с агара, сразу, как только появляется хобби - микология.

 

 

Цитата

"Никколо Макиавелли"
Умный сразу делает то, что в конце концов делает дурак.

 

 

Не бойся неудач. Агар дает нам возможность проводить работы с культурами в очень маленьких пространствах и проводить множественные эксперименты с большим количеством регистрируемых данных. Чашки петри дешевые, так что не привязывайтесь к ним. Не отчаивайся от контаминантов. На самом деле, вы можете узнать намного больше от неудач, чем от успехов. Если вы мыслите критически, вы можете выучить намного больше из зараженной чашки, например: какие техники НЕ работают, что вы делаете неправильно, почему контаминация на агаре, как мицелий реагирует на эти раздражители, насколько экстремальной должна быть ваша стерильная техника и.т.д. Для сравнения, ОСОБЕННО с таким выносливым видом, как cubensis, успех практически ничему нас не учит. Так что учитесь воспринимать свои неудачи как возможность учиться, и максимально использовать свой опыт в будущем. Используй свой опыт удач и неудач, и ты будешь последовательно успешен, просто будь терпеливым и настойчивым, сохраняя объективность.

 

Насчет СаБа и Ламинара

 

 

Чтобы работать успешно с агаром, вам нужно быть знакомым со стерильными техниками  и вам понадобится либо SAB (камера неподвижного воздуха), либо FH (ламинарный шкаф/бокс). Какой бы маршрут вы ни выбрали, важно понимать основные принципы работы с данными устройствами.

 

САБ:

 

Принцип работы SAB = "неподвижный воздух" означает, что вы НИКОГДА не сможете получить полностью стерильный бокс, но парадокс в том, что вы сможете выполнять стерильную работу, когда сам бокс не стерильный. Неподвижный Воздух - вот как работает SAB. В SABе мы рассчитываем на удаления частиц / загрязнений из воздуха последствием гравитации, а сама коробка блокирует помехи / турбулентность снаружи.

 

Поэтому очень важно, чтобы вы понимали, что контаминанты сконцентрированы на дне SABа, и по этой причине я НАСТОЯТЕЛЬНО рекомендую поместить влажное полотенце под SAB и работать на небольшой подставке над ним.  Идея заключается в том, чтобы создать некоторое пространство между вашими чашками и горизонтальной поверхностью стола, на котором полно контаминантов, а полотенце помогает задерживать загрязнения и предотвращает их движение, когда вы двигаете руками.

 

Это также одна из причин, по которой некоторые люди используют небольшие контейнеры вместо чашек петри, поскольку контейнеры pp5 всегда имеют высокий обод, намного выше чем у петри (как правило, в несколько дюймов), и, следовательно, имеют более высокие борта межу грязным полом и агром. Разливание агара в SABе без промежутка между чашкой, в которую вы наливаете, и полом/столом/дном может иметь огромное значение, например: я сделал примерно 5 тыс. чашек без полотенца и еще 15 тыс. с ними, единственное изменение в добавлении полотенца привело к тому, что мой показатель успеха вырос с 94% до 99% (от 1/20 до 1/100)

 

Две разные конструкции Саба и петри с культурой.

 

 

этот обычный бокс на самом деле получился действительно великолепным, я люблю эту штуку, бокс был встроен в шкаф, стоял внутри шкафа, чтобы использовать стены самого шкафа для дополнительной блокировки воздушных потоков и это было стелсово, бокс был достаточно высоким даже для пластиковых мешков, оглядываясь назад, я советую всем иметь такой бокс (базовый SAB - это все, что вам нужно)

 

 

Ламинарный бокс/шакф/стол: FH

 

В ламинарном потоке воздух пропускается через HEPA фильтр (высокоэффективный фильтр воздушных частиц), который удаляет все находящиеся в воздухе загрязнения для поддержания стерильных условий. Ламинарный бокс состоит из префильтра, мотора и фильтра HEPA.

так что это ПОЛНОСТЬЮ отличается от SABа с точки зрения принципов использования для обеспечения стерильной работы. в SABе мы полагаемся на неподвижный воздух, а в FH (Ламинарный бокс) мы полагаемся на ламинарный поток стерильного воздуха.

 

 

Я и мой Ламинар

 

 

Приготовление Агара.

 

Как и все, что мы делаем в этом хобби, важно, чтобы мы понимали, что мы делаем. При работе с агаром нам нужна слегка питательная среда, которая будет поддерживать контролируемый рост в двух измерениях. По этой причине почти любя среда, которую мицелий сможет переварить, будет работать нормально (исторически люди использовали картон и всякие разные смеси). В наши дни большинство людей предпочитают либо MEA ((Солодовый экстракт) стандарт в про микологии), PDA (картофельный агар с декстрозой), либо GSA (агар на сваренном зерне), поскольку мы используем их для достижения одного и того же результата, не имеет значения, какой рецепт вы используете. до тех пор, пока вы соблюдаете правильный баланс агар-агара и сахара.

 

 

Собираем все в месте

 

 

многим микологам нравится использовать агар «в пол силы» с половиной нормального содержания сахара, чтобы побудить мицелий распространяться и искать пищу, а не питаться и сидеть на месте, и еще чтобы нам было легче проводить секторизацию и видеть другие различия в характеристиках мицелия. Мой предпочтительный рецепт - это рецепт MEA "половинчатой силы" (20г агар-агара, 15г экстракта светлого солода, 1 л воды), который я иногда чередую с PDA или GSA.

 

Я экспериментировал с разными рецептами и препаратами агара и вот к чему я пришел, самые простые рецепты являются лучшими для получения однородных результатов. Пептон и дрожжи часто приводят к тому, что мицелий ведет себя очень странно, и в конце концов я перестал ими пользоваться, потому что я осознал, что сосредоточение внимания на питательных средах агара (помимо того, что требуется для здорового, стабильного роста), пустая трата времени.

 

Если вы планируете делать много работы с агаром и хотите делать какие-то осмысленные выводы о том, как одна культура выглядит / действует по сравнению с другой, важно стандартизировать свой рецепт приготовления агара (найдите что-то, что вам нравится, и придерживайтесь), иначе вы не сможете узнать, соблюдаете ли вы все характеристики культуры или есть разница из-за другого рецепта.

 

Антибиотики совершенно не нужны в этом хобби, так как вы можете убрать почти все загрязнения с помощью своевременных трансферов. Я держу под рукой гентамицин и хлорамфеникол и иногда использую его, но это, конечно, не должно быть само собой разумеющимся. Единственное, для чего я его использую, - это пред финальной пересадкой, перед тем, как сделать скошенный агар длительного хранения, чтобы уничтожить любые скрытые бактерии. Я не использую антибиотики в мастер слантах, только пред последней партией, и обычно не использую их даже в этих случаях (они не нужны). Я также использовал его перед тем, как делать а2g (в редких случаях, когда я пытаюсь выявить подозреваемые скрытые бактерии), или когда отпечаток настолько невероятно грязный, что бактерии подавляют рост мицелия на стандартном агаре (я видел такое только дважды). и я думаю, что кто-то вытер задницу этими отпечатками).

 

 

Я заказывал агар-агар у многих поставщиков и не вижу большой разницы в бактериологическом (ДОРОГОМ) виде, из магазина по продаже диетических продуктов или каких-то лабораторий. Если это чистый агар-агар, белый /почти белый порошок, все должно быть в порядке. Я предпочитаю покупать оптом, но чаще всего в конечном итоге использовал дешевый из азиатских магазинов.

 

 

Старый бренд Агара

 

 

Чтобы сделать мой стандартный MEA, мне нравится использовать 2-литровый химический стакан, чтобы все там смешивать. Сначала я выставляю ноль на пищевых весах с химическим стаканом на нем, затем насыпаю 20 г (немного больше / меньше, не страшно) агар-агара вот так:

 

Отмеряем агар в миксере

 

Затем я снова взвешиваю на 0 и засыпаю 15 г (светлого) экстракта солода и смешиваю 2 сухих порошка:

 

 

затем добавьте небольшое количество холодной воды, чтобы смешать порошки в густую жидкость. Мне нравится использовать стеклянную палочку для перемешивания, чтобы смешать эту суспензию как можно более равномерно:

 

концентрированная агаровая суспензия

 

 

и затем добавляю холодную воду, пока общий объем не станет 1 литром и хорошо перемешиваю:

 

1 л агаровой суспензии

 

теперь я добавляю пищевой краситель, который можно читать полезным по двум причинам: # 1 он помогает сортировать культуры визуально для цветовой кодировки, а # 2 окраска позволяет намного легче обнаружить здоровый белый мицелий и различить контаминанты

 

Добавляем пищевые красители (опционально)

 

Затем я использую микроволновку, чтобы тщательно вскипятить суспензию агара и растворить смесь в гомогенный раствор. Агар ОЧЕНЬ странный, когда он кипит, он может легко начать пузыриться и это не очень хорошо. По этой причине вам нужно внимательно следить за этим и регулярно помешивать агар. Обычно я врубаю на полную мощность, а затем уменьшаю мощность микроволновки до 50%, чтобы поддерживать контролируемое кипение, чтобы оно не пузырилось очень сильно. Даже при пониженной мощности мне приходится открывать ее каждые несколько минут. Нужно проверить чтобы быть уверенным что все растворилось в однородную массу -  подержать еще чуток и все, можно доставать.

 

посматривайте за агаром или получиться месиво

 

Затем я беру полотенце и оборачиваю его вокруг стакана, чтобы я мог с ним справиться, и выливаю содержимое через воронку, выстланную марлей, наполняя 2 флакона по половине. Цель фильтра марли состоит в том, чтобы удалить любые комки или посторонние частицы, которые могут все еще быть в вашем агаре, чтобы быть   уверенным в однородности массы. В результате получается кристально чистый агар, который выглядит как стекло, и делает ваш разлив по петрям предсказуемым. После наполнения закрутите крышки, затем едва раскрутите их  обратно, чтобы пар мог выходить во время цикла стерилизации.

 

разливаем агар через фильтр - подготовка к стерилизации.

 

Я люблю стерилизовать свои скальпели в то же время, когда я делаю агар, обычно 8 штук или около того за один раз, чтобы мне не приходилось делать это часто. Я отрываю кусочек алюминиевой фольги, оборачиваю его вокруг скальпеля и складываю как будто конверт, смотрите рисунок. Затем помещаю все что я хочу простерилизовать в банку с крышкой и стерилизую вместе с агаром.

 

 

Эти литровые флаконы не поместятся в мою скороварку, если я поставлю их прямо вверх, поэтому мне нужно ловко приспособить их как-нибудь.  Для этого я кладу 4 маленьких банки на один край и 2 кольца от крышек на другой. Я ставлю их на наискосок, нижний край к кольцам, чтобы бутылки с носителем не соприкасались с краями скороварки.

 

агаровые бутылки загружены в скороварку

 

Затем я наливаю горячую воду в скороварку, пока она не достигнет уровня агара в бутылках, затем закройте крышку и закрепите ее. Теперь мы вентилируем скороварку, оставляя клапана открытыми, пока не будет достигнут постоянный выброс пара. Запустите таймер на 10 минут этого будет достаточно.

 

Вентилируем скороварку

 

По истечении 10 минут наденьте веса. Теперь дайте давлению начать расти. Когда он поднимется выше 15 фунтов на квадратный дюйм, запустите таймер на 20 минут и поддерживайте 15-18 фунтов на квадратный дюйм в течение этого времени.

 

Стерилизуем 20 минут

 

 

ВНИМАНИЕ: это немного не кошерно, но..., я приведу обоснование, которое, как говорится в каждом руководстве, позволяет скороварке обнуляться самостоятельно. Естественно, когда вы выключаете газ, давление начинает падать. В моих ранних работах с агаром у меня были некоторые проблемы с агаром из-за открытия скороварки, когда давление было отрицательным, что приводило к засасыванию грязного воздуха из кухни в мои бутылки с агаром в скороварке. Отрицательное давление в скороварке будет держаться какое-то время даже после 0 после остывания, как и положительное если открыть крышку раньше.  Самый правильный вариант - это естественное регулирование давлений в разных сосудах - но это очень долго.

То, что мне нравится делать сейчас, немного нетерпеливо, но я не вижу никаких проблем с этим методом на чашках петри от 15 до 20 тыс., которые я сделал с помощью этого метода. Вот что мне нравится делать: я внимательно слежу за давлением, когда оно падает, затем сразу же, как оно достигает нуля, прямо перед тем, как оно пересекает линию, я открываю вентиляционное отверстие. это означает, что из клапана выпускается небольшое шипение положительного давления (что хорошо, потому что это означает, что ничего не всасывается), с меньшим и меньшим давлением по мере приближения к нулю, с созданием отрицательного давления. Так что прямо перед нулем я надеваю защитные перчатки / перчатки, открываю клапан, открываю скороварку, сразу же затягиваю крышки на флаконах с агаром и вынимаю их из скороварки.

 

 

Крышки затянуты и можно доставать из скороварки

 

Теперь подождите, пока он не остынет примерно до 60 градусов по Цельсию. Как правило, я пытаюсь налить его до того, как он начнет гелеобразоваться,что то около 50 градусов. Мне нравится использовать инфракрасный термометр, чтобы проверить это, это действительно удобно. Если у вас нет ИК-термометра, просто подождите, пока он не остынет достаточно, чтобы было удобно брать в руки и лить в петри.

 

Агар стерилизован - можно разливать

 

 

Разливание по Чашкам

 

Теперь мы перемещаем агар в нашу чистую рабочую зону. Я собираюсь продемонстрировать принципы работы с ламинарным боксом, но в SAB применяются те же принципы. Вы, наверное, заметили, что многие люди преуспевают в микологии, даже если они не одевают перчатки, и наплевательски относятся к чистоте у них получается растить грибы, но почти что всегда это кубенсис - или любые другие сильные виды, но как только такие люди сталкиваются с серьезными видами, требующими работы с агаром они терпят поражение раз за разом, постоянно, и сильно недоумевают таким поражением. Со временем появляется некий опыт, который можно использовать по-разному и допустим понимать -  какие углы вы можете срезать, где можно сделать чуточку легче. Тем не менее, когда вы впервые работаете над чистыми культурами / спаунами, хорошей идеей будет: использовать как можно более стерильные техники, пока вы не сможете стабильно и надежно достигать чистого результата - спауна / культур. В общем, когда вы видите, что кто-то говорит, что не одевает перчатки или инокулирует без протирания спиртом, или еще что ни будь вроде этого - это не означает, что вы должны делать также (по крайней мере, до тех пор, пока вы не сможете стабильно повторять результаты). Точно также это работает и в обратную сторону - если человек хвалиться тем что он не пользуется вообще не какими стерильными техниками и бравирует своей крутизной, знайте, что - это просто новичок с одной отработанной техникой, который вас ничему не сможет научит, держитесь от таких подальше. Важно понять, как динамика стерильных техник играет для вас лично, и нужно узнать, что и как работает для вас, в вашей среде.

 

Рабочая зона

 

  

В течение долгого времени я носил маски для лица, но мое лицо всегда становилось потным / горячим и неудобным через некоторое время. В конце концов я начал использовать защитную маску, и она мне нравиться. Эта штука отлично подходит для блокирования вашего дыхания (вы можете кашлять прямо в нее, не беспокоясь), а также предотвращает падение волос и клеток кожи с вашего лица и головы в сторону рабочей поверхности. Еще одна вещь, которую я люблю использовать, это перчатки для тяжелых работ. Они держатся намного лучше, чем стандартные перчатки, особенно при многократном использовании. Я снова и снова использую одну и ту же пару перчаток и протираю их спиртным перед каждым сеансом. Еще мне нравится хранить тряпку, пропитанную 70% -ным спиртом (это опасно, поэтому будьте осторожны) в пластиковом пакете в контейнере, чтобы алкоголь не испарялся, пока я его не использовал. Я вытаскиваю эту тряпку и регулярно протираю ей все что можно во время работы с агром.

 

Шлем и спиртовая тряпка

 

теперь я вытаскиваю рукава из 60-80 чашек и переворачиваю их вверх дном. используя скальпель, я отрезаю конец каждого рукава, затем поворачиваю их правой стороной вверх и стягиваю пластиковые рукава следующим образом:

 

чашки на подставках

 

 

Затем я использую тряпку для спирта, чтобы вытереть предплечья и перчатки, затем тщательно  протрите первую бутылочку с агаром. обычно крышка очень плотно закрыта, поэтому я ослабляю ее с помощью ремешка, а затем вынимаю вручную

 

ремешок помогает открутить любые крышки

 

затем я центрирую стопку из 20 чашек и использую плоскую сторону бутылки, чтобы выровнять их так:

 

использую бутылку для центровки

 

Затем я беру 19 верхних чашек и крышку самой нижней левой рукой приподнимаю затем начинаю вливаю агар в нижнюю чашку. Если чашка нужна для долгого грова, я заливаю слой, покрывающий весь пол блюда, затем закрываю крышку и перехожу к следующей чашке (что является кошерным способом так делать). Либо можно налить совсем чуть-чуть для простого переноса. Обычно я стараюсь максимально увеличить количество чашек, которые я получаю на литр агара, даже несмотря на то, что агар, возможно, высохнет через несколько недель (нужно понимать, что вы растите чтобы знать точное количество). Я делаю это, заливая примерно от 1/3 до 1/2 количества агара, необходимого для покрытия дна чашки, затем наклоняю чашку взад-вперед, чтобы агар покрывал всю поверхность тарелки. Это приводит к очень тонкой агаризованной среде, которая легко высыхает, но также имеет некоторые преимущества (например, не засоряет иглу LI агаром (Li-agar - взвесь из агара и воды), поскольку все, что вы инокулируете таким агаром, будет почти что чистый мицелий, очень маленькое количество агара). Открытие чашек - это, несомненно, возможный вектор заражения, поэтому я не рекомендую просто так это делать, пока вы получите чистую культуры. Пересадки в SAB это менее рискованно, чем для FH, поскольку при использовании FH необходимо соблюдать особую осторожность, чтобы ваши руки не попали между потоком и средой. Другое преимущество супертонких чашек заключается в том, что при переносе кусочков в другие чашки они легче отделяются. По этой причине, даже при использовании чашек с агаром стандартной толщины, я хотел бы срезать мицелий так, чтобы он был как можно более тонкими (обрезая не колонизированный агар под мицелием) перед трансфером)

 

 

 

тонкие чашки, используеться техника наклона, чтобы распределить агар. это проще всего, когда агар относительно горячий, потому что, когда он начинает застывать образуются комки, поверхность деформируется и не будет равномерной

 

 

 

когда я заканчиваю стак, я беру его вот так и перемещаю в сторону, затем выстраиваю новый стак из 20 чашек:

 

отодвигаем готовый стак

 

Получается около 30-50 чашек (в зависимости от того, насколько тонкий слой я налил) моя первая бутылка на 500 мл пуста, поэтому я повторяю вытирание спиртом и использую ключ-ремешок еще разок, чтобы раскрутить крышку, прежде чем аккуратно открутить крышку вручную:

 

 

готовим вторую бутыль

 

 

 

 

       Затем я снова выпрямляю стопку и возобновляю схему: поднимите крышки + стопку, залейте 1 / 3 1 / 2 чашки, закройте чашку, снова поднимите, наклоните назад и вперед до тех пор, пока не останется оголенных участков в петри. Если агар начинает густеть, я начинаю заливать чашки без подъема / наклона.

 

наполняем оставшиеся чаши

 

 

Работа с чашками:

 

 

 

 

приблизительно так должно выглядеть рабочее место - если ты много работаешь с агаром. подставка для скальпеля, два разных агара, горелка, зиплоки - все готово к работе

 

 

 

Подготовка скальпеля:

 

Когда я начинаю работать с чашками, мне нравится начинать каждую сессию, открывая свежий скальпель из одного из этих конвертов которые мы стерилизовали ранее (это необязательно, пламя работает тоже хорошо). Мне нравится делать из алюминиевой фольги небольшую стойку-держатель, где один конец свернут, чтобы удерживать конец лезвия на возвышении, чтобы оно ничего не касалось. Я поставил эту импровизированную подставку для скальпеля в дальнем правом углу моего рабочего пространства.

 

готовим к работе скальпель N11 - и делаем импровизированную подставку под скальпель.

 

 

 

                 Далее немного о настройке пламени - стерилизации скальпеля. Я очень люблю этот бренд Blazer горелка Bunsen Burner. Этот японский бренд в целом топчик (их горелки, а не топливо), и я долгое время был поклонником их Big Shot GT8000 для концентратов (он разогревается менее чем за 10 секунд) каждый кто его видит заходит и покупает одну штуку, это как гребаный световой меч пламени, ха-ха). Бутановая Bunsen Burner является УДИВИТЕЛЬНОЙ для наших целей, потому что она разогревает скальпель примерно за 2 секунды. Единственным реальным недостатком является пьезо-воспламенение, которое (как и все эти воспламенители этого типа) со временем изнашивается при чрезмерном использовании. У меня было 3 GT8000s, и я все еще пользуюсь 2, зажигание на моей первой горелке Bunsen сломано. По этой причине мне нравится использовать комбинированный подход, когда я использую алкогольную лампу, чтобы зажечь бутан по мере необходимости. Если бы я делал только несколько чашек за один раз, я бы, вероятно, просто оставил пламя, включенное на все время, но он слишком быстро нагревается.

 

используем бутановую горелку и простую горелку для стерилизации скальпеля

 

 

Затем я достаю чашку из контейнера/стопки/пачки - осматриваю культуру (иногда с помощью ювелирной лупы или увеличительного стекла). чтобы хорошо все рассмотреть, мне нравится держать свет под стойкой рабочего пространства, которую я включаю для подсветки по мере необходимости, а также держу культуру на свету, чтобы хорошо все было видно.

 

инспектируем культуру

 

 

 

Итак, хороший способ провести следующую часть (взять образец для трансфера) - это поставить чашку на рабочую поверхность, слегка приподнять крышку и быстро надрезать квадрат образца 1-4 мм в дальней стороне от эпицентра (куда растет мицелий). Перенести. Мне нравится смотреть на мицелий, поднимать блюдо и наклонять его так, чтобы свет отражался от поверхности агара. это позволяет нам видеть закономерности, искажения и дефекты, которые в противном случае невидимы для нас, и это может помочь вам обнаружить колонию бактерий, которую вы могли бы неосознанно перенести с помощью вашего мицелия. Если вы собираетесь заниматься трансферами, важно, чтобы у вас был гладкий ровный агар, иначе вы не сможете сделать какие-либо выводы из искажений отражающей поверхности.

 

используем отражение света - чтобы найти спрятанные контамы перед тем как сделать пересадку

 

 

После этого мы переносим кусочек агара в новую чашку и маркируем ее маркером(черный для MS, красный или синий для клонов или изолятов). Я обычно работаю со стопками по 8 чашек за раз и начинаю с верха и работаю вниз. Затем мы слегка поднимаем крышку, и помещаем образец ткани в центр. В прошлом я наносил агар прямо в центр моей чашки, как будто «прикалывал его в центр, вдавливал чтобы освободить скальпель», но прекратил делать это по нескольким причинам. Главным образом, это приводит к тому, что рисунок роста вытягивается вокруг траншеи (а не становиться равномерно круглым). Это может показаться немного нелогичным, но все, что вам нужно сделать, это положить кусок ткани на агар в центре и слегка потянуть в сторону, тем самым освобождая ваш скальпель, независимо от того, находится ли он правой стороной вверх, вверх ногами, на боку или что-то еще, не имеет значения. Поверхностное натяжение между двумя поверхностями агара (или мицелия и агара, если его перевернуть) будет более чем достаточно, чтобы удержать его на месте, и рост будет равномерным. Если вы попытаетесь отрегулировать его несколько раз или ударите, или что-то в этом роде, он может будет скользить и елозить повсюду, или даже разбиваться на куски, и в дальнейшем вам будет трудно делать какие-либо выводы из формы получившейся колонии. Просто не роняйте тарелки, работайте аккуратно, все придет с опытом!

 

трансфер образца в новую чашку

 

 

 

 

Теперь я заверну готовую чашку в парафильм/скотчь/изоленту итд.

 

заматываем чашку в парафильм.

          

Мне нравится складывать каждую чашку в отдельный Ziploc, поскольку они стерильны, что делает их более долговечными, удобными в обращении при проверке вне стерильной среды.   

 

индивидуальный зиплок для каждой чашки

 

 

Работа со спорами:

 

Так как грибы плодоносят на открытом воздухе, мы можем предположить, что споры не стерильные. Если кто-то отправляет вам отпечаток споры, вы можете предположить, что на нем будут контаминантные пятна в дополнение к спорам. Это не означает, что вы получили плохой отпечаток, это означает, что вы получили нормальный отпечаток. То же самое относится и к взвесям. По этой причине при инокуляции чего-либо спорами целесообразно использовать как можно меньше количество спор, поскольку нам нужно всего лишь несколько спор, и чем больше раствора / спор мы используем, тем больше загрязнений будет также присутствовать. Я рекомендую людям никогда не инокулировать споры непосредственно на зерно, так как скорее всего вы будете культивировать плесень.

 

Стерильная банка с зерном - это, по сути, микробиологический джекпот для всего, что может его переварить (грибки, бактерии и.т.д.), поэтому мы должны позаботиться о том, чтобы уменьшить вероятность культивирования неправильных микроорганизмов. В основном, у меня ВСЕГДА прорастают споры сначала на агаре, и после я инокулирую зерно /жм/ и.т.д.

 

Используя методы нанесения штрихов, вы можете легко очистить даже самые грязные отпечатки или шприцы со спорами. Используете петлю для распространения спор очень тонким слоем по поверхности агара, создавая различные зоны с различными концентрациями спор. Это чрезвычайно полезно для очистки отпечатка, так как вы распределяете загрязнения тонкими штрихами и тоже время вы распространяете споры и плесень будет во многих местах, но не везде, именно оттуда где плесени не будет, стоит делать трансфер. Это также отличный способ получить изоляты примерно на 100 трансферов раньше, чем вы получили бы их из сгустка спор в одном месте, поскольку в более концентрированных зонах очень мало штаммов присутствующих в каждой колонии. Выполняя одну из этих техник серийных нанесений, вы получаете сотни колоний с различным генетическим разнообразием, что дает вам много шансов выбрать энергичную, организованную культуру.

 

 

Цитата

 

В микробиологии штриховой метод - это метод, используемый для выделения чистого штамма из одного вида микроорганизмов, часто бактерий (в нашем случае грибов). Затем образцы могут быть взяты из полученных колоний, и микробиологическая культура может быть выращена в новой чашке, чтобы можно было идентифицировать, изучить или протестировать организм.

 

Полосы - это быстрый и в идеале самый простой способ разведения изолятов. Смысл техники -  путем разбавления сравнительно большой концентрации бактерий до меньшей концентрации. Уменьшение количества бактерий(нанесением полос) должно показать, что колонии достаточно разнесены друг от друга, чтобы обеспечить разделение микробов разных типов. Для нанесения полос используют стерильный инструмент, такой как ватный тампон или обычно инокуляционная петля. Асептические методы используются для поддержания микробиологических культур и предотвращения загрязнения питательной среды. Существует много различных типов, методов, используемых для посева на чашку. Выбор метода зависит от индивидуальных предпочтений и может также зависеть от количества микробов в пробе.

 

Трехфазный штриховой рисунок, известный как T-Streak, рекомендуется для начинающих. Для нанесения штрихов используется стерильный инструмент, такой как ватный тампон или петля. Петлю сначала стерилизуют, накаляя ее до красна. Остудить петлю можно в часке  в которую вы соберитесь инокулировать. Когда петля остыла, ее погружают в образец пациента, содержащий много видов бактерий. Затем инокуляционную петлю зигзагообразно перемещают по поверхности агара взад и вперед до тех пор, пока приблизительно 30% чашки не будет покрыто. Затем петлю повторно стерилизуют и чашка поворачивается на 90 градусов. Начиная с ранее законченного участка, петлю перетаскивают через него два-три раза, продолжая зигзагообразный рисунок. Затем процедуру повторяют еще раз, проявляя осторожность, чтобы не коснуться ранее нанесенных полос. Каждый раз, когда петля собирает все меньше и меньше бактерий, пока не соберет только отдельные бактериальные клетки, которые могут вырасти в колонию. Пластина должна показать самый тяжелый рост в первом разделе. Второй раздел будет иметь меньший рост и несколько изолированных колоний, в то время как последний раздел будет иметь наименьшее количество роста и много изолированных колоний.

 

 

примеры полосчатых техник. разные лаборатории используют разные стандарты для нанисения полос.

 

 

То, как я люблю это делать, очень похоже на то, что описано выше.  Возьмите вашу петлю и соскребите небольшое количество спор с отпечатка (или капните каплю из шприца прямо на петлю) и нанесите на агар, как показано ниже. Затем снова раскалите петлю, Спор больше не нужно, поверните чашку петри и начинайте штриховать петлей по агару, как это показано на картинке. Повторите несколько раз.

                                                                                                         

это моя любимая техника - почистить споры, какой-нибудь изолят, или старый жм.

 

 

Если вы используете взвесь в качестве отправной точки (или LC, который вы пытаетесь освежить), вы должны быть очень осторожны, чтобы не добавлять дополнительную жидкость в чашку, в противном случае она будет вращаться и искажать рисунок штрихов. Поэтому убедитесь, что вы не капаете в чашку, вы не должны добавлять жидкости в чашку больше чем прилипает к петле.

 

 

 

Заключение:

 

Я также приветствую любые дополнительные советы и рекомендации, отзывы, критику, обсуждение, дебаты, хейтеров  итд  или любое другое критическое мышление.

Спасибо всем за все, что вы сделали, чтобы сделать это место таким невероятным ресурсом.

Я так благодарен, что живу в эпоху, когда есть онлайн-сообщество, с которым мы можем сотрудничать в наших увлечениях 

 

VIdeo

 

 

 

 

Афтор репорта - c10h12n2o 
Афтор перевода - WarFlop
Адаптировал текст как мог, кое где не смог ;) результаты перевода могут не совпадать с оригиналом, но смысловая нагрузка таже.

 

Изменено 6 марта 2019 пользователем WarFlop

[WarFlop]

reserve for a SAB 

 

тут будут техники работы в сабе, тексты переведены, нужно немного допилить.

Изменено 4 марта 2019 пользователем WarFlop

[WarFlop]

Reserve for a agar recipes

тут  нужно будет перевести, хороших рецептов много.

Изменено 4 марта 2019 пользователем WarFlop

[POPSA]

Жесткий репорт, не у каждого дома лаба))

[WarFlop]

@POPSA Лаба и не нужна 

 

 

[POPSA]

А ты дрожжи тоже не добавляешь? Для чего они хоть нужны?

[Panda!]

Статья еб#йшая WarFlop молодец! Было бы здорово прочесть более подробно об устройстве ламинара этого человека.

[Smurf]

WarFlop, если есть статья по ламинару от этого человека то милости просим выложи нам если даже и на забугорном языке

[Smurf]

С цитатой Макиавелли не соглашусь, и так и так строится жизнь, за какое время будет что-то сделано это важно только самому человеку. 

[Zipporol]

Можно ли использовать для приготовления агара, ржаной солодовый экстракт?

[Hamsabala]

3 часа назад, Zipporol сказал:

Можно ли использовать для приготовления агара, ржаной солодовый экстракт?

Можно, но только светлый.

[Caterpiller2000]

В 24.03.2020 в 17:24, Hamsabala сказал:

Можно, но только светлый.

А можно поподробнее?    Есть в продаже на озоне концетрат недорогой  

Войдите или зарегистрируйтесь для просмотра содержимого. Купить семена конопли.

    ячменно солодовый. Он не подойдет?

[Hamsabala]

@Caterpiller2000 я ничего не скажу про экстракты и концентраты. Я использую простой, не ферментированный (светлый) молотый солод, который делаю сам.

Темные солоды во время стерилизации могут карамелизоваться

[Zipporol]

В 04.04.2020 в 16:49, Hamsabala сказал:

@Caterpiller2000 я ничего не скажу про экстракты и концентраты. Я использую простой, не ферментированный (светлый) молотый солод, который делаю сам.

Темные солоды во время стерилизации могут карамелизоваться

Понял, спасибо! Еще вопрос, имеет ли смыл контролировать Ph среды, так как пишут что грибам лучше что бы был ph 5-6, или это не так критично? И что вы используете для заклеивания чашек обычный пластырь или покупаете специальную уплотнительную ленту для чашек петри?

Изменено 16 апреля 2020 пользователем Zipporol

[Hamsabala]

53 минуты назад, Zipporol сказал:

имеет ли смыл контролировать Ph среды

Работая с агаром не имеет.

 

54 минуты назад, Zipporol сказал:

И что вы используете для заклеивания чашек

Я использую Parafilm. Но из-за непростой текущей обстановки в дело идёт обычный скотч.

[Hatarakimas]

В 16.04.2020 в 15:41, Hamsabala сказал:

Работая с агаром не имеет.

 

Я использую Parafilm. Но из-за непростой текущей обстановки в дело идёт обычный скотч.

есть еще круче вариант , малярная лента шириной 1.5 см .  тот же parafilm только можно купить в соседнем хозмаге. Приклеиваеться и отклеивается хорошо 

[Nick Nick]

Если я правильно понял суть метода, то вот такой бытовой лайф хак.

Варим минут 20 зерно. Например овёс. Пару столовых ложек на литр воды. Снимаем с огня. Остужаем. Снимаем с осадка. Снова кипятим несколько минут. Добавляем желатин и немного красителя. Можно обычный пищевой желатин? Фильтруем. И разливаем для стерилизации.

[Hamsabala]

@Nick Nick 

Верно

Лучше побольше зерна. А если так мало, то с желатином добавить грамм 5 фруктозы/декстрозы.

[JOHN REMBO 1777]

бро круто очень.а как грибы скрещивать знаешь?

[JOHN REMBO 1777]

как из двух сортов получить один?есть литература почитать?

[Nick Nick]

4 минуты назад, JOHN REMBO 1777 сказал:

как из двух сортов получить один?

Никак. Для задающего подобные вопросы - абсолютно никак.

[allan]

Рад что прочитал, что узнал (вот так в свободной интернет форме), что есть такие что не прячут знания , а делятся. Хотя понятно что это практические знания любого лаборанта (наверное). но для нас доморощеных, самое то! 

Теперь понятно по работе с взвесями.

 

Пришла взвесь

Пустить на агар (несколько чашек)

Получается агар храниться дольше чем ЖМ?

я про "сохранить штамм".  так его сохраняют? сколько он хранится?   

 

поправьте если не так что спрашиваю

[allan]

не пойму , какие чашки нужны.

 

много пластиковых продается. тоже подходят? или только из боросиликата брать?

 

как их потом очищать? или просто мыть стерилить и все?

 

они приходят сразу чистыми?

 

Верхняя крышка больше диаметром (накрывается на дно(оно меньше))? верно?  но здесь в инструкции агар льется в крышки, стопки перевернуты вверх дном?  на нем же и конденсат собирается?  почему так?  или я понял не так.  льется в дно , а крышкой накрывается.

 

перечитаю еще раз

[vladivam]

@allan   бро одноразовые , готовое залить запечатать и на хранение . Слышал я что человек ( в баночке не в петри хранил 5 лет).  А в крышки лется  чтобы потом как перевернуить( однозначно) не образовывалась и не капала влага (вот только откуда в ней ?ненужные м.о. появились( перепад темератер меж чашкой и агаром сразу , чем  медленей процесс , тем менше влаги )
Я не слишком опытен в микологии , ( в том году опыты с агаром пошли не удачно , немерен заново ), но по специальности вполне мог стать когда то микробиологом.
Бро одноразовую посуду думаю не стоит , царапина , и все даже спирт может не помочь , а если нагрееш то все

Изменено 18 сентября 2021 пользователем vladivam

[allan]

@vladivam   штамм на агаре до 5 лет в сохране? то что нужно.

спасибо