Агар-репорт. Получение ризоморфного мицелия на агаре

[UltraFreak]

Поставил цель получить ризоморфную монокультуру на агаре штамма P. Cubensis RustyWhyte.

Для этого собрал SAB, + приобрёл дополнительный инвентарь:

 

 

(SAB использую без полотенца, но в качестве меры очистки внутреннего пространства применяю кварцевую лампу 25W с озоном, антисептик ИПС ~70% включительно)

 

 

Как видно на фото выше САБ стоит на раскладном столике, такой же стул рядом с ним. Набор бюджетный, легко складывается и убирается в сторону в случае ненадобности.

 

Агар готовил по рецепту:

100мл воды

2г порошка агара

2г лёгкого солодового экстракта

 

 

После соединения всех ингредиентов взбалтываем их в бутылке, далее ставим её в скороварку (обязательно на подставке, т.к. температура кипения воды не поднимется выше 100°С, именно пар даёт температуру в 115-120°С при автоклавировании!), подставка как на фото ниже стоит всего 2-4$, зато благодаря этому предмету вы будете стабильно получать качественный результат.

 

 

(Расстояние в 5см от дна скороварки до края подставки используется как резервуар для воды).

 

Как поставили бутылку и налили воды закручиваем винт скороварки и ставим её на максимальный режим нагрева, как только засвистит пар, выходящий через клапан, сразу убавляем мощность нагрева до 40-50% и оставляем стерилизоваться на 40-60 минут.

 

Как только скороварка сбросит давление мы аккуратно достаём горячую бутылку с агаром (используем прихватку-рукавицу или полотенце, банка очень горячая) и перетряхиваем содержимое для равномерного расстворения агара, после этого несём его к САБу для остужения. Очень важно дождаться пока агар остынет до такой температуры, когда мы сможем без последствий брать в руки горячую бутылку для розилива агара по чашкам, но в то же время нужно следить, чтобы агар не остыл до слишком низкой температуры, иначе он загустеет в бутылке (работать нужно быстро).

 

Это один из примеров разлитого агара по чашкам петри, на первом фото - сразу после розлива агар остужается, в моём случае процесс затвердевания занял более 90 минут, на втором фото - уже затвердевший агар, на который был засеян кусочек агара с ризоморфным мицелием, в таком пластиковом коробе я отправляю его в инкубатор t 29-30°C.

 

Как я сказал выше на агаре у меня уже есть ризоморфный мицелий. Как я его получил?

На момент написания данного текста эта история практических экспериментов длится примерно месяц. Будет проще, если разделить этап каждого засева чашек петри на T - transfer (перенос),

к примеру T0 - нулевой трансфер, т.е. засев агара споровым материалом.

 

(Я использовал данную технику нанесения спорового материала)

 

Из партии чашек с T0 мицелий визуально был практически полным пухом, но отобрав наиболее перспективные на вид чашки я выбрал и срезал с них участки, отдалённо похожие на ризоморфы, перенёс их на новую партию петри (это уже T1).

Спустя несколько дней после прорастания мицелия мы можем оценить мицелий и на данный момент выбрать наиболее перспективного кандидата.

 

Например, эта культура мне показалась самой лучшей в плане скорости роста и визуально похожей на гифы:

 

 

Данную чашку я выбрал для дальнейших пересадок, остальные показали результаты гораздо более худшие, вследствии этого они были забракованы.

Как вы уже догадались, с этой чашки я также срезал наиболее красивые участки, перенеся их на новую партию агара (T2). С данной партии мне удалось получить 2 чашки с визуально мощными ризоморфами:

 

 

Для более высокого шанса на закрепление стабильного результата в партии чашек T3 я взял 16 чашек с агаром, на каждую из них высадил по кусочку ризоморфного мицелия из этих двух чашек.

 

В планах получить ризоморфную монокультуру, как на этом фото:

(фото не моё)

 

 

После получения такой монокультуры и череды переносов для закрепления результата можно начать гров с засева зерна, после обрастания сделать ТУБ и клонировать с 1-2 волны лучших кандидатов на агар, несколько раз сделать из этого мицелия трансфер и ризоморфный клон будет готов! Уже можно смело делать монотубы на крупные объёмы мицелия, не беспокоясь, что у тебя вырастут несколько грибочков на первой волне (когда я гровил с мультиспоры у меня так всё и было, не понимаю тех, кто гровя со взвеси стабильно снимает лес грибов, этих чернокнижников я ещё постараюсь разоблачить). К завершению первой части добавлю некоторые забракованные образцы:

 

На фото - мицелий перенесённый с кейка, можно увидеть паутинную плесень.

 

В данном случае - бактериальная контаминация и ещё неопознанная черная зараза (плесень?). В некоторых местах колонии бактерий образуют красивые рисунки, напоминают мне узоры при морозе на старых окнах.

 

С момента публикации агар-репорт запущен в режиме реального времени, с прогрессом в результатах репорт будет дополняться.

 

Изменено 4 августа 2021 пользователем UltraFreak

[Gesges]

Молодец, успехов в освоении и леса грибов?

[hant8086]

@UltraFreak привет, отличный эксперимент. Красивые образы мицелия получились.

Ризоморф сила, ждем вида плодовых тел с такого изолята!

[UltraFreak]

Результаты с пересадки ризоморфа весьма неплохие, из 16 чашек я отобрал 8 самых лучших. Из этих 8 есть пара наилучших, с мощными участками, но есть одно но: в них поселилась бактериальная контаминация, не на всех участках, но на многих (изначально мощные ризоморфы на родительских чашках проросли на заражённых участках).

Далее планирую сделать перенос ризоморфа на T4 (6-8 чашек), а также попробовать инокулировать 1 банку зерна мощным ризоморфным мицелием из чашки петри (в дальнейшем, в случае успеха попробовать размножить его методом g2g)

 

 

Пришёл к выводу, что застывший агар в закрытых бутылках со временем выдаёт контаминацию, которая при повторном приготовлении свежего агара со старым проявляется на свежеразлитых петри (в данный момент 2 бутылки с агаром на дне были залиты водой и отправлены в скороварку на максимальной мощности для очистки от возможных бактерий).

[Gen_Guru]

Отличная проделанная работа!

Выглядит здорово

[vladivam]

@UltraFreak Бро вопрос к тебе , в том году тоже пытался эксперементировать с агаром , перепробовал несколько видов агара остановился на кондитерском 600 ( выпрашивал у девченок , даже номер телефона дали  (не воспользовался)), но я солод не добовлял а на другом ресурсе вычитал что он не обязателен . Разной концентрации пробовал и отвара и агара ( некоторые  Петри вообще ничего постороннего  , пересадка зарастает и даже начинал мицелий появляться на субстрате , но на этом все тормозилось , возможно что ничего не шло из за солода иди дело в чем то другом ?  И еще один маленький вопрос панеолусы тоже дают розоморфный мицелий ?

[UltraFreak]

@vladivam  

2 часа назад, vladivam сказал:

возможно что ничего не шло из за солода иди дело в чем то другом ?  

Сомневаюсь что дело в солоде, солод это только катализатор для роста мицелия. Ты изначальный материал для мицелия проращивал из спор на агаре, или перенёс из другого источника? (обросшее зерно, кусочек гриба).

Если со спор, то проверь качество стерилизации агара, могли бактерии остаться в нём, делать стерилизацию лучше всего в скороварке.

2 часа назад, vladivam сказал:

панеолусы тоже дают розоморфный мицелий ?

Насколько мне известно они не дают ризоморфный мицелий, там селекция проводится несколько другим способом, вроде по параметру пуховидности и скорости роста.

[vladivam]

13 минуты назад, UltraFreak сказал:

. Ты изначальный материал для мицелия проращивал из спор на агаре, или перенёс из другого источника?

Инокулировал и кусочкам гриба и споровой взвесью ( ей потом 8 банок инок все пошли на ура Хоть 4 простоял  долго в холодильнике (заросли без призднаков заразы)  Насчет стерилизации агара хорошо что подсказал  , доводил до кипения что бы растворить агар , и один раз стелилиз. дедовским методом на пару но 20 мин

[LINBtrgdbkb]

Всем привет!

У меня вопрос- каким образом мне наносить споровый материал как показано выше на схеме? Тоесть изначально мне надо капнуть капельку споровой взвеси и дальше согласно схеме ее размазывать по чашке? А чем размазывать? ватной палочкой? (не понимаю как ее стерилизовать)

[Pik]

В 27.07.2021 в 10:59, UltraFreak сказал:

температура кипения воды не поднимется выше 100°С, именно пар даёт температуру в 115-120°С при автоклавировании!),

Ерунду пишешь.

Температура кипения и есть 115-120°С.

Изучи физику.

Чем больше давление, тем выше температура кипения.

[Rumikon]

Доброго вечера, @UltraFreak ! Можно узнать у вас, где приобреталась подставка под чашки петри, которая стоит у вас внутри САБа и как это называется? Всю голову сломал

[vladivam]

В 21.08.2021 в 18:45, LINBtrgdbkb сказал:

А чем размазывать? ватной палочкой? (не понимаю как ее стерилизовать)

Бро ни каких палочек не нужно , простой способ изготовить инокуляцианную петлю , береш спицу желательно из нержавейки толщиной 1 -2мм длиной см 20 приблизительно кончик расплескиваеш на наковальне и ззагинаеш на конце маленькую петельку ручку обматываеш изо лент.  пластиковой или уплотнителем для турб с водой  или лучше постаратся и свернуть ручку и стерелезуй хоть в воде хоть в спирт.

 Бро не в обиду сказано но ты насмешил , ( где купить подставки к чашкам петри) , изготовь дело то пустяковое.

Да какоет время назад итересовался сдесь почему у меня не пошол агар и ж.м. Походу дело было в стерилизации стерилзовал в кастрюльке 1 раз 20 мин. Не чего не шло, сейчас все норм и ж.м. пошол и на агаре начало расти ( но эксперементы пока не проводил токмо попробовал) , стал стерилизовать дважды через сутки по 10 - 15 мин.

 

 

[Rumikon]

Понятно, что можно изготовить, но во первых, не хочется заморочек, а во вторых хочется красиво. Может кто знает название этой штуки? Чтобы хоть знать куда смотреть.

На счёт дробной стерилизации, действительно отличный способ. Стерилизую так зерно и коковерм, проблемм не было

[vladivam]

3 минуты назад, Rumikon сказал:

Понятно, что можно изготовить, но во первых, не хочется заморочек, а во вторых хочется красиво

О вкусах не спорят. А у меня уже  пару лет как записан в " кружок очумелые ручки " ( люблю смастерить или усовершенствовать подручными материалами (конечно не имею ввиду тех. устройства )

[mashwer]

если лампа больше размерами чем САБ, при размещении ламп над боксом ее лучи проникают через пластик или нет???

[Pik]

В 27.07.2021 в 10:59, UltraFreak сказал:

т.к. температура кипения воды не поднимется выше 100°С, именно пар даёт температуру в 115-120°С при автоклавировании!)

 

Повышается как температура пара, так и температура кипения воды.

То есть, и вода кипит при 115-120 С.

Таковы законы физики.

 

16 минут назад, mashwer сказал:

если лампа больше размерами чем САБ, при размещении ламп над боксом ее лучи проникают через пластик или нет???

Какие именно лампы имеются в виду?

Для роста грибов достаточно слабого света диодной лампочки в 2-5 ватт.

Лампочка может просто лежать на коробке, такая слабая лампочка почти совсем не греется.

 

Изменено 9 февраля 2022 пользователем Pik

[mashwer]

2 часа назад, Pik сказал:

 

Повышается как температура пара, так и температура кипения воды.

То есть, и вода кипит при 115-120 С.

Таковы законы физики.

 

Какие именно лампы имеются в виду?

Для роста грибов достаточно слабого света диодной лампочки в 2-5 ватт.

Лампочка может просто лежать на коробке, такая слабая лампочка почти совсем не греется.

 

нет, я про лампу кварцевую. Если она бОльшего размера чем предпалагаемый САБ и в него не поместится, при размещении ламп над пластиковм сабом пространство в пластиковом сабе кварцуется? или волн ламп об пластик бьются и пространство в сабе не будет стерильным? (понимаю что лучше б она внутри была, но запихнуть внутрь пока не получатеся

[Pik]

1 час назад, mashwer сказал:

нет, я про лампу кварцевую. Если она бОльшего размера чем предпалагаемый САБ и в него не поместится, при размещении ламп над пластиковм сабом пространство в пластиковом сабе кварцуется? или волн ламп об пластик бьются и пространство в сабе не будет стерильным? (понимаю что лучше б она внутри была, но запихнуть внутрь пока не получатеся

Не нужна лампа. Снаружи она не имеет смысла.

Каждый раз, когда используешь САБ,  помещаешь все необходимые материалы внутрь коробки, помещаешь и надёжно крепишь крышку на коробку (я приклеивал горячим клеем, легко держится и снимается), вставляешь руки в перчатки и опрыскиваешь внутреннюю часть коробки аэрозольным дезинфицирующим средством перед выполнением любой работы внутри коробки.

Можно использовать мыльную воду, можно спиртовое дез.средство.

 

Использование мыльной воды даёт возможность прокаливать, турбозажигалкой можно прокаливать иглы.

После опрыскивания внутри надо чуть подождать, чтобы частицы осели.

 

Изменено 9 февраля 2022 пользователем Pik